Nat Chem Biol：针剂转化为口服药片的研究

从 8448 个环肽中，成功打造出一款可口服的凝血酶抑制剂

许多亟需攻克的疾病靶点蛋白，至今缺乏能够口服的药物。有些蛋白表面平坦光滑，小分子难以找到嵌入的口袋；另一些虽存在结合位点，却难以实现高选择性，容易误伤同家族的其他蛋白。过去，这类难题常依赖抗体等大分子生物药——但它们几乎只能通过注射给药。

介于小分子与生物药之间的环肽，原本被视为极具潜力的中间体：尺寸足够小，同时能像大分子一样精准锁定棘手靶点。自然界已经提供了例证——环孢素 A、去氨加压素以及某种生长抑素类似物，都是天然存在且可口服的肽类药物。然而，它们属于少数幸运者。绝大多数天然或人工设计的肽，要么分子偏大、表面亲水性强，要么无法耐受消化道中的蛋白酶，最终只能制成注射剂。

这项来自洛桑联邦理工学院（EPFL）Christian Heinis 团队、发表于《Nature Chemical Biology》的研究，旨在解答一个长期悬而未决的问题：是否能够从零开始，针对特定靶点，设计出既能精准结合、又可口服吸收的小环肽。

三道关卡，相互制约

口服肽类药物之所以困难，在于它必须同时突破三道彼此牵制的障碍。

第一道关卡是消化道内的蛋白酶。胃中的胃蛋白酶、肠道中的胰酶，其天然功能就是将蛋白质和肽链切割成氨基酸。第二道关卡是肠壁：分子必须穿越肠上皮细胞的脂质膜才能被吸收，而肽通常体积大、表面极性基团过多，如同一团亲水线球，难以穿过油性膜层。第三道关卡是肝脏：被吸收进入门静脉的分子，第一站便是肝脏，那里充满了代谢酶，会为分子添加各种修饰、加速其清除，即所谓首过代谢。

研究人员早已总结出可口服肽的典型特征：分子量低于 700 道尔顿、极性表面积小于 200 平方埃、氢键供体不超过五个。但这并非绝对法则——环孢素 A 分子量高达 1,203 道尔顿，却凭借大量 N-甲基化以及可蜷缩隐藏极性表面的构象，仍能实现口服。

真正的难点不在于绘制理想画像，而在于制造出既符合画像特征、又能恰好结合特定靶点的肽。要找到这样的分子，必须从海量候选物中筛选。过去常用噬菌体展示或 mRNA 展示构建大库，但这类生物展示库的化学多样性有限，大多仅使用天然氨基酸，难以得到既短小又高亲和力的结合肽。Heinis 团队此前曾用噬菌体展示开发抗消化道蛋白酶的环肽，即便最小的也有九个氨基酸、分子量 1,134 道尔顿，体积过大且亲水性强，在小鼠体内的口服生物利用度仅有 0.2%。

从二硫键转向硫醚键

Heinis 团队此前的策略，是在微孔板中利用声波分液技术，以纳摩尔级微量规模逐一合成环肽，粗产物不经纯化直接用于筛选——他们曾以此方式造出两万个环肽，并发现了纳摩尔级的结合分子。然而，这批环肽采用二硫键环化，而二硫键存在致命缺陷：在还原环境中易被打开。

这恰恰是口服途径的拦路虎。分子穿越细胞时，细胞内是还原性环境，二硫键会被还原、环状结构解体，肽随之散架。因此，这套高效的合成筛选方法一直无法用于口服肽的研发。这项工作的关键一步，便是将环化所用的化学键从二硫键更换为硫醚键。

硫醚环化还有一个对建库极为有利的优点：反应干净且高效。两端带有巯基的线性肽，与一个含有两个反应位点的连接子混合后，几乎可以定量完成环化。正因为反应副产物少，粗产物中杂质含量低，才敢不纯化直接用于筛选——这是实现规模化、构建大文库的前提。

不过，硫醚键的弱点也需提前摸清：硫原子容易被氧化，而氧化主要来自肝脏中 CYP450 家族酶系，即首过代谢这一关。团队首先合成了十个结构各异的双硫醚环肽 1–10，将其置入大鼠肝微粒体（从大鼠肝细胞中分离、富含代谢酶的组分，常用于预测肝脏代谢清除速率）中，观察其耐受性。结果差异显著：最不稳定的肽 1 半衰期仅约 11 分钟，最稳定的肽 2 则长达 133 分钟；被氧化的肽会多出 16 或 32 的质量，对应添加一个或两个氧原子。以两种已上市口服药维拉帕米和地尔硫卓作为基准，十个环肽中有九个与其相当或更稳定，其中最稳定的四种清除率甚至慢四倍以上。

双硫醚环肽的合成思路与代谢稳定性。图 a 展示了整体建库策略：两端带巯基的线性肽先通过双亲电连接子环化，随后在外围氨基上连接一个羧酸，m 种肽 × n 种连接子 × o 种羧酸，组合出规模庞大的环肽库。图 b 列出了十个随机环肽 1–10 的结构及其在大鼠肝微粒体中的半衰期，可直观看出稳定性差异巨大。图 d 将十个肽的清除率与两种口服药进行对比，显示哪些肽比药物更稳定。

双硫醚环肽的合成思路与代谢稳定性。图 a 展示了整体建库策略：两端带巯基的线性肽先通过双亲电连接子环化，随后在外围氨基上连接一个羧酸，m 种肽 × n 种连接子 × o 种羧酸，组合出规模庞大的环肽库。图 b 列出了十个随机环肽 1–10 的结构及其在大鼠肝微粒体中的半衰期，可直观看出稳定性差异巨大。图 d 将十个肽的清除率与两种口服药进行对比，显示哪些肽比药物更稳定。

不纯化，直接筛选

要将这套思路转化为可规模化合成的方法，核心在于将两步反应串联起来，且中间不进行纯化：先完成硫醚环化，紧接着在环肽外围的氨基上连接羧酸（酰化）。两步反应只需按顺序向微孔板中加入试剂即可。

这两步反应过去虽各自被使用过，但从未被串联在一起。团队先用八个两端带巯基、且含一个氨基的随机肽（P1–P8）进行探索。这些肽在 96 孔板中通过半胱胺树脂合成，依靠乙醚沉淀即可获得不错的纯度，八个肽的平均纯度达到 93%，全程无需色谱纯化。

接着测试环化效率：将八个肽分别与四个连接子（L1–L4）两两组合，共 32 个反应。为确保分子内成环优于分子间副反应，反应在低浓度（1 毫摩尔）、大体积（1 毫升）下进行，连接子用量为两倍。32 个反应的环化效率平均为 85%，最主要的副产物是二硫键环化的肽，在大多数反应中占比不到 1%，最高也只有 15%。随后测试酰化：将环化完成的肽与八个羧酸（A1–A8）组合，在 384 孔板中以 500 皮摩尔的微量、50 纳升的反应体积进行，室温反应 8 小时，结果几乎实现定量酰化。

环化与酰化两步反应的效率验证。图 a 以示例肽展示完整流程：线性肽先环化，用 β-巯基乙醇淬灭多余连接子，再进行酰化，三张色谱图分别对应三步后的产物。图 b 展示了八个肽与四个连接子的环化产率，图 c 展示了酰化产率，可见两步反应对不同序列和试剂均具有广泛的适应性。

环化与酰化两步反应的效率验证。图 a 以示例肽展示完整流程：线性肽先环化，用 β-巯基乙醇淬灭多余连接子，再进行酰化，三张色谱图分别对应三步后的产物。图 b 展示了八个肽与四个连接子的环化产率，图 c 展示了酰化产率，可见两步反应对不同序列和试剂均具有广泛的适应性。

八千多个环肽，瞄准凝血酶

有了合成方法，团队选择凝血酶作为模型靶点进行验证。

不带电的口服凝血酶抑制剂一直难以开发。Heinis 团队此前制备的凝血酶环肽，要么带有电荷（无法穿透细胞膜），要么采用二硫键环化（不耐还原）。此次他们专门设计了一个文库：不含任何电荷，采用硫醚键环化。每个肽由六个构件组成——两个随机氨基酸、两个固定巯基构件（如半胱氨酸）、一个随机连接子、一个随机外围羧酸。十个备选羧酸中包括 A11，它本身能够微弱地结合凝血酶的 S1 口袋。

他们首先合成了 384 个两端带巯基的短肽（四种格式理论上可组出 400 个，实际获得 384 个），平均产量为 4.4 微摩尔，不经纯化；随后使用两个连接子进行环化，十个羧酸（外加不加酸的对照）进行酰化，最终得到 8,448 个环肽，全部直接保留在合成板中待筛选（384 × 2 × 11 = 8,448）。这批环肽的物化性质分析显示，绝大多数超出了“五规则”的范围——虽然分子量不大，却与经典小分子有明显差异。

筛选直接在合成板中进行：向反应孔中加入凝血酶以及一种遇酶切割会发荧光的底物，将肽稀释至 10 微摩尔，检测残余的凝血酶活性。在 8,448 个反应中，有 73 个（0.9%）将凝血酶活性抑制了一半以上。将结果绘制成热图，可观察到非常整齐的规律：所有最活跃的肽，外围连接的均是 A11 或 A12 这两个羧酸。对最强的 20 个命中肽重新合成并复测，活性几乎不变，说明这套合成与筛选方法非常稳健。

对这 20 个肽进行构效分析，归纳出六组结构相似的肽（11–30）。重新合成纯化后测定抑制常数（Ki），均落在纳摩尔级别，其中环肽 11 表现最佳，对人 α-凝血酶的 Ki 为 82 ± 10 纳摩尔。最强的第一组（11–16）共享一个 Cys-Phe 基序，半胱氨酸的氨基上连接着氯噻吩。

8,448 个环肽库的构成与凝血酶筛选结果。图 a 列出了建库所用的全部积木：十个侧链各异的氨基酸、十个改变骨架的氨基酸、十个二氨基酸、两个连接子、十个羧酸，以及四种肽的格式。图 b 以直方图展示整个文库的物化性质（分子量、极性表面积、氢键供体等），灰色部分表示超出“五规则”的肽，可见绝大多数都越界。图 c 展示了第一组六个最强命中肽（11–16）的结构及其各自的 Ki 值，共同骨架以黑色标出。

8,448 个环肽库的构成与凝血酶筛选结果。图 a 列出了建库所用的全部积木：十个侧链各异的氨基酸、十个改变骨架的氨基酸、十个二氨基酸、两个连接子、十个羧酸，以及四种肽的格式。图 b 以直方图展示整个文库的物化性质（分子量、极性表面积、氢键供体等），灰色部分表示超出“五规则”的肽，可见绝大多数都越界。图 c 展示了第一组六个最强命中肽（11–16）的结构及其各自的 Ki 值，共同骨架以黑色标出。

没有一个肽能三项全优

找到高亲和力的结合肽只是第一步。能否口服，还需考察另外三项体外指标：抗蛋白酶能力、细胞膜穿透性以及在肝脏中的清除速率。团队将 20 个肽（11–30）逐一进行了检测。

抗蛋白酶实验：将肽分别浸泡在模拟胃液（pH 1.2 的胃蛋白酶）和模拟肠液（pH 6.8 的胰酶）中，37°C 孵育 8 小时。大多数肽保持稳定——团队将此归因于它们主要由非天然氨基酸组成、分子量小、构象不易松动。

膜穿透性实验：采用 PAMPA 人工膜系统测定被动扩散能力。20 个肽的穿透性差异极大：有的能快速扩散，有的几乎纹丝不动。换算为表观渗透系数（logPapp），范围从几乎不穿透的约 −8 到完全穿透的约 −5，表现最好的六个肽在 −6.0 到 −5.2 之间，已接近参照药物华法林（−5.3）。

代谢稳定性实验：仍使用大鼠肝微粒体。结果显示，只有五个肽的清除速率慢于维拉帕米——团队将维拉帕米（一个清除偏快的口服药）定为可接受的稳定性下限。

将三项结果放在一起审视，结论非常清晰：每一项中都有几个肽表现不错，但没有任何一个肽能在三项指标上全部达标。

凝血酶抑制肽的体外表征与子库筛选。图 a 将肽 11–30 的四项指标（对人/大鼠凝血酶的抑制、抗胃肠液降解、人工膜渗透、肝微粒体代谢稳定）逐一列出，可直观看出没有哪个肽四项皆优。图 b 展示了基于环肽 11 构建子库时，在苯丙氨酸、连接子、半胱氨酸三个位点上用于替换的积木。图 c 展示了优化后一批肽（31–37）的同样四项表征数据。

凝血酶抑制肽的体外表征与子库筛选。图 a 将肽 11–30 的四项指标（对人/大鼠凝血酶的抑制、抗胃肠液降解、人工膜渗透、肝微粒体代谢稳定）逐一列出，可直观看出没有哪个肽四项皆优。图 b 展示了基于环肽 11 构建子库时，在苯丙氨酸、连接子、半胱氨酸三个位点上用于替换的积木。图 c 展示了优化后一批肽（31–37）的同样四项表征数据。

一轮一轮，补上短板

既然没有现成的完美分子，团队便从最强的肽 11 出发，进行多轮迭代优化。高效的合成方法使得这种小规模快速测试几乎零成本。

第一轮，团队保留肽 11 中的 β-高脯氨酸和氯噻吩不变，仅在另外三个位置（半胱氨酸、苯丙氨酸、连接子）上更换不同的积木，构建了一个包含 168 个成员的子库（8 种苯丙氨酸 × 7 种连接子 × 3 种半胱氨酸）。这一轮还采用了一个巧妙的设计：将粗反应混合物直接加入 PAMPA 板的供体孔中，然后同时测定供体孔和受体孔中的凝血酶抑制活性。

读数表明：更换苯丙氨酸会大幅削弱活性，但替换半胱氨酸侧链和连接子仍可接受；受体孔数据显示，使用 L1 和 L4 连接子环化的肽，其膜穿透性明显优于原先使用砜基连接子 L2 的肽，其中 L4 在活性和穿透性方面均表现最佳。从挑出纯化的肽 31–37 中，最强的是肽 32：对人及大鼠凝血酶的 Ki 分别为 8.9 和 1.10 纳摩尔，比母体肽 11 强十倍。该肽抗蛋白酶、能穿透细胞膜，几乎全部达标，仅有一项例外：肽 32 在肝微粒体中清除速度异常快（260 微升/分钟/毫克），代谢稳定性不足，无法进入体内实验。

问题再次回到硫醚键。对肽 32 进行质谱分析，发现随着孵育时间增加，出现 +16 和 +32 的质量峰，指向硫醚键被氧化，很可能生成了亚砜。既然硫原子是软肋，干脆将其全部去除。第二轮，团队采用全碳氢连接子重新环化肽 32，依靠固相上的关环复分解（RCM）完成。

在七个通过 RCM 环化的肽 38–44 中，表现最佳的是肽 43：对人及大鼠凝血酶的 Ki 分别为 50 和 11.1 纳摩尔，代谢稳定性较肽 32 提高了三倍（清除率 85），且仍具备膜穿透能力。至此，肽 43 终于达到了进入体内实验的条件。

采用碳氢连接子环化的肽（基于肽 32）。图 a 展示了七个通过 RCM 环化的肽 38–44 的结构，连接子长度各不相同。图 b 描绘了 RCM 在固相上的合成步骤。图 e 将肽 32 与其 RCM 类似物 43 在肝微粒体中的稳定性进行对比，43 明显更稳定。图 f 展示了肽 43 在大鼠体内的口服与静脉血药曲线，图 g 显示口服后肽 43 在胃肠道各段大部分保持完整，但已能检测到少量被氧化的产物。

采用碳氢连接子环化的肽（基于肽 32）。图 a 展示了七个通过 RCM 环化的肽 38–44 的结构，连接子长度各不相同。图 b 描绘了 RCM 在固相上的合成步骤。图 e 将肽 32 与其 RCM 类似物 43 在肝微粒体中的稳定性进行对比，43 明显更稳定。图 f 展示了肽 43 在大鼠体内的口服与静脉血药曲线，图 g 显示口服后肽 43 在胃肠道各段大部分保持完整，但已能检测到少量被氧化的产物。

灌进大鼠的胃里

将肽 43 灌入大鼠胃中（n=3），血样分析表明它确实进入了血液循环：30 分钟后血浆峰浓度为 183 纳摩尔，口服生物利用度为 4.5%。作为阳性对照，他们使用了 Lokey 实验室设计、专门具备高膜穿透性的环六肽 1NMe3，该肽在相同条件下的口服生物利用度为 27%。

4.5% 仍不够理想。为了弄清肽 43 在体内的遭遇，团队再次给大鼠灌药，30 分钟后取出胃、小肠（十二指肠和空肠、回肠分开）及大肠分别分析。结果显示大部分肽保持完整，但在消化道中已能发现一些被氧化的肽（多出 16、32 的质量）。这提示只要进一步封堵残余的氧化位点，生物利用度还有提升空间。

第三轮的目标是消除肽 43 上最后一个氧化位点。质谱未能精确定位氧化发生的位置（找不到被氧化的碎片），但团队怀疑是氯噻吩基团。于是他们又进行了一轮快速替换：固定环状结构部分，仅在外围氨基上更换不同的羧酸。考虑到肽 43 很可能结合在凝血酶的 S1 口袋，他们挑选了 17 个同样能塞入 S1 口袋的羧酸进行测试，以氯噻吩作为阳性对照。

筛选出的肽 45 和 46 活性均与母体肽 43 相当。其中活性略强的肽 46，用 4-氯苯甲酸替换了氯噻吩，对人及大鼠凝血酶的 Ki 分别为 65 和 10.3 纳摩尔，抗蛋白酶和膜穿透性均良好，在肝微粒体中的稳定性又比肽 43 提升约一倍。专一性测试表明，肽 46 对凝血酶具有选择性抑制（对其他几种胰蛋白酶样蛋白酶基本无影响），且属于竞争性抑制剂。最后测试口服效果：肽 46 的血浆峰浓度达到 400 纳摩尔，是肽 43 的两倍；口服生物利用度升至 18.4%，已接近专为穿透设计造的参照肽 1NMe3 的 27%。

从肽 11 到肽 32（效力提高十倍），到肽 43（替换硫醚、可进入体内），再到肽 46（封堵最后氧化位点、口服生物利用度达 18%），这条优化路径上的每一步，都精准针对上一轮暴露出的短板。

代谢更稳定、口服效果更佳的环肽 46。图 a 展示了基于肽 43、将外围氯噻吩替换为 17 种类似羧酸的子库，下方热图为这些肽对人及大鼠凝血酶的抑制强度。图 b 为肽 46 的化学结构。图 e 将肽 32、43、46 三者在肝微粒体中的稳定性进行对比，可看出逐代改善。图 f 为肽 46 的专一性谱，仅凝血酶被显著抑制。图 g 为肽 46 在大鼠体内的口服与静脉血药曲线，口服生物利用度为 18.4%。

代谢更稳定、口服效果更佳的环肽 46。图 a 展示了基于肽 43、将外围氯噻吩替换为 17 种类似羧酸的子库，下方热图为这些肽对人及大鼠凝血酶的抑制强度。图 b 为肽 46 的化学结构。图 e 将肽 32、43、46 三者在肝微粒体中的稳定性进行对比，可看出逐代改善。图 f 为肽 46 的专一性谱，仅凝血酶被显著抑制。图 g 为肽 46 在大鼠体内的口服与静脉血药曲线，口服生物利用度为 18.4%。

这套方法的能效与局限

这项工作的真正成果，不仅是获得了一个口服生物利用度达 18% 的凝血酶抑制肽，更是一套可反复使用的肽类药物开发方法：利用硫醚环化构建可直接筛选的大规模文库，借助声波分液技术合成成千上万个环肽，再通过能同时评估结合与膜穿透能力的子库筛选，逐步将候选肽推向口服化。这套方法适用于任何具有功能读数的靶点。

但作者也明确指出了其局限性。

〔边界〕第一，硫醚键是否适合直接成药，作者坦言目前尚不确定。一方面，几种已上市的口服药本身含有硫醚键，他们的一些测试肽稳定性甚至超过了这些药物；另一方面，他们最强的几个肽恰好卡在硫醚氧化问题上，不得不替换。结论是稳定性很可能取决于具体序列，需要逐例分析。一个更彻底的策略是从一开始就采用 RCM 的全碳环，省去后续更换连接子的麻烦——但要使 RCM 能够高效环化大量不同肽段，仍需要大量技术开发。

第二，该肽目前还不能作为药物使用。要达到药理活性所需的亚纳摩尔级亲和力还有差距；作者所用均为市售构件，认为通过定制构件有望进一步提升。此外，RCM 环上的碳碳双键几何构型尚未确定，肽 46 本身即为 E/Z 异构体的混合物。

第三，目前所有的体内证据均来自大鼠，且靶点仅涉及凝血酶。方法的普适性仍停留在理论论证与单个成功案例层面，尚未在更多靶点——尤其是更具挑战性的靶点（如蛋白-蛋白相互作用）上得到验证。

团队特别强调了不带电的设计理念。大多数凝血酶抑制剂需要依靠带电基团结合 S1 口袋，而带电几乎注定难以口服；这批肽则完全不带电，从源头上绕开了这一难题——这也是它们能比达比加群酯实现更好口服效果的根本原因。

将注射剂变为药片

很长一段时间里，肽类药物被困在尴尬的境地：它们结合靶点的能力一流，却几乎必须通过注射给药。这项研究并未声称解决了所有问题——所制备的肽距离真正的药物尚有距离，证据也仅限于大鼠和单一靶点。但它成功将一件原本依赖运气和大量手工劳动才能偶然达成的事情，转化为一个可逐步逼近目标的过程：每暴露一个短板，就有方法去修补；每修补一次，就离口服更近一步。

如果这套方法的简便与稳健性能如作者期望的那样被广泛应用，那么那些至今只能靠注射、甚至无药可用的棘手靶点，或许终有一天会等来一颗可直接吞服的小环肽。将注射剂变为药片，其意义远不止于便利——它决定了一种药物能否真正走进那些原本无法触及它的人们的生活。

参考文献

原文 De novo development of small cyclic peptides that are orally bioa vailable（Merz、Habeshian、Li 等，通讯作者 Christian Heinis，EPFL），发表于《Nature Chemical Biology》2024 年第 20 卷 624–633 页，DOI 10.1038/s41589-023-01496-y。

本文为开放获取（CC BY 4.0），原始数据随论文一并提供；利益声明中，通讯作者等为衍生公司 Orbis Medicines 的创始人。