Nat Biotechnol：人工智能优化逆转录酶提升Prime Editing效率

Prime editing（PE）作为一项能够实现“搜索-替换”式精准基因编辑的关键技术，其潜力毋庸置疑。然而，一个长期存在的挑战是：经过实验室进化优化了催化活性的系统，往往会“附带”一些我们不想要的副作用——比如逆转录酶（RT）的稳定性下降、可溶性表达减少以及蛋白折叠效率变差。这些问题直接限制了Prime editor在细胞内的有效浓度，尤其是在依赖瞬时表达的mRNA递送、LNP递送乃至体内治疗等场景下，最终拖累了编辑效率。

最近，一项研究为我们提供了一个巧妙的解题思路。研究人员没有继续在催化活性上“内卷”，而是调转方向，利用人工智能引导的蛋白质重设计策略，对已经进化过的RT结构进行了一次“稳定性修复”。他们采用了像ProteinMPNN这样的基于结构的深度学习模型，在牢牢守住催化核心区域的前提下，对RT外围的大量残基进行了重新设计。最终得到的新RT变体，虽然包含了多达30到163个氨基酸替换，却奇迹般地保留了逆转录功能，同时显著提升了热稳定性、蛋白折叠稳定性和可溶表达水平。

结果令人振奋。新设计的PE8系列Prime editors在多种细胞类型、不同递送方式以及小鼠体内实验中，都展现出了更高的编辑效率。在部分体内模型中，其效率相比此前最先进的PE6、PE7和PEmax系统，最高提升了2.9倍。这项研究有力地证明，AI驱动的蛋白重设计可以作为实验室进化的重要补充，为开发下一代基因编辑工具提供了一种通用性策略。

优化之路：从活性到稳定性的平衡

Prime editing技术巧妙地将Cas9切口酶与逆转录酶结合，能够在不造成DNA双链断裂的前提下，实现碱基替换、小片段插入和缺失等多种精准操作。凭借其高精度和低副产物特性，它被广泛视为下一代基因治疗的明星工具，已在多种遗传疾病动物模型中成功完成修复，并展现出临床应用的潜力。

过去几年，研究人员通过蛋白质工程和实验室连续进化技术（如PACE）不断优化Prime editor，催生了像PE6这样具有更高逆转录活性和编辑效率的版本。但硬币总有另一面：这类旨在提升活性的定向进化，常常会带来一个典型的“副作用”——蛋白质稳定性下降。许多通过进化获得高活性的蛋白，实际上可能因为折叠不稳定、易于聚集或表达量低，而难以真正应用于治疗体系。

对于Prime editor这种由近2000个氨基酸构成的大型多结构域蛋白而言，稳定性问题尤为突出。蛋白在翻译过程中高度依赖协同折叠与分子伴侣辅助，任何稳定性的削弱都可能导致错误折叠、核糖体停滞甚至被降解。因此，仅仅提升催化效率是远远不够的，提升整体的“蛋白质量”同样关键。

与此同时，AI驱动的蛋白质设计技术正在飞速发展。诸如ProteinMPNN等深度学习模型已被证明能够在保持蛋白功能的同时，有效改善其稳定性与折叠性质。这自然引出了一个关键问题：我们能否利用AI，对已经“进化过”的RT进行重新设计，在不破坏其催化功能的前提下，恢复甚至增强其稳定性和表达能力？

方法：AI如何为进化后的RT“补强”

研究团队首先确认了问题所在：分析PE6、PEmax等系统中的RT结构发现，经过实验室进化后的RT，在细胞中的蛋白表达量明显低于野生型RT。针对此，他们建立了一套系统的AI辅助蛋白重设计流程。

这套流程首先基于AlphaFold预测RT结构，然后利用ProteinMPNN对允许变异的区域进行序列重设计。为了确保不“伤及根本”，研究人员固定了靠近催化核心、底物结合位点以及进化上高度保守的氨基酸，仅对外围区域进行改动。通过设置不同的距离和保守性阈值，他们生成了384个RT候选变体，并进一步用AlphaFold2筛选其结构的可信度及与原始结构的相似性。

随后，这些经过筛选的RT被重新整合到Prime editor中，并通过LNP-mRNA递送、细胞编辑实验、ClinVar致病突变修复筛选、原代细胞编辑、eVLP递送以及小鼠体内递送等多种方式，系统性地评估其性能。

图1：实验室进化RT的表达下降与AI重设计流程。

结果：性能的全面提升

实验室进化后的RT存在明显稳定性缺陷

初步比较就揭示了问题：包含实验室进化RT的PE6a、PE6c和PE6d，其蛋白表达量显著低于野生型RT版本以及普通的Cas9核酸酶。特别是在mRNA-LNP递送条件下，进化RT版本的峰值蛋白水平下降了约1.5到2倍。这清晰地表明，实验室进化在提升催化能力的同时，确实牺牲了蛋白的稳定性与表达能力。

接下来，ProteinMPNN登场，对RT进行了大规模重设计。AI模型在保留催化核心结构的同时，对外围区域进行了广泛替换，部分变体中甚至有超过40%的残基被重新设计。令人惊讶的是，AlphaFold2分析表明，这些新RT虽然序列差异巨大，但整体三维结构依然保持高度保守。

AI重设计RT显著提高Prime editing效率

随后在Hepa1-6细胞中的测试给出了答案。在174个测试变体中，95%的RT仍保留Prime editing活性，而约30%的设计版本性能超过了原始的PE6或PEmax系统。

其中表现最佳的变体，编辑效率提升显著：

• 相比PEmax，最高提升约2.3倍
• 相比PE6a，提升约1.7倍
• 相比PE6c，提升约1.3倍
• 相比PE6d，提升约1.4倍

值得注意的是，这些提升是在原本已经具有较高编辑效率的基础上实现的。这说明AI重设计确实改善了Prime editor的整体性能，而不仅仅是简单地恢复活性。研究还发现，那些更严格保留进化保守位点的设计通常性能更好，这提示我们，天然进化中筛选出的关键功能残基对于维持RT功能至关重要。

图2：PE8系列在细胞中的Prime editing效率提升。

PE8系统能够高效修复ClinVar致病突变

为了验证新RT的广泛适用性，研究人员构建了一个包含700种ClinVar致病突变的Prime editing筛选体系。结果显示，多个AI重设计的RT在大多数致病突变的修复中均优于原始PE系统。

其中：

• PE8a平均编辑效率提升约2.1倍
• PE8c提升约1.4倍
• PE8d提升约1.4倍
• PE8max提升约1.2倍

在MSH6、LDLR、KCNJ2、TRIOBP等多种疾病相关基因中，新系统均实现了更高的修复效率。研究人员最终将表现最佳的变体命名为PE8a、PE8c、PE8d和PE8max，这些系统的整体性能均超过了此前广泛使用的PE6与PE7系统。

图3：ClinVar 700种致病突变修复筛选。

AI重设计显著提高RT表达量与热稳定性

性能提升的背后，机制是什么？进一步分析揭示了答案：

• PE8c蛋白表达量提升约2.3倍
• PE8d提升约2.0倍
• PE8max提升约2.1倍

与此同时，PE8c的熔解温度（Tm）相比PE6c提高了约8°C，表明其热稳定性显著增强。细胞外表达实验也显示，AI重设计的RT具有更高的可溶蛋白产量。这说明ProteinMPNN不仅优化了局部结构，还改善了整体蛋白的折叠性质。这种稳定性的全面提升，被认为是PE8编辑效率提高的重要原因之一。

图4：PE8系列RT的蛋白表达与热稳定性分析。

PE8在原代细胞、eVLP和小鼠体内均表现更强编辑能力

研究的验证并未止步于细胞系。在更接近临床应用的体系中，PE8同样表现优异：

• 在原代人类CD34+ HSPC中，PE8c针对HBB位点的编辑效率相比PE6c提升约1.6倍，并达到了约50%的编辑效率。
• 在人T细胞中，PE8d在IL2RB位点也表现出更高编辑效率。
• 在eVLP递送体系中，PE8c在Dnmt1位点的编辑效率达到78%，相比PE6c提升约1.6倍。
• 在小鼠体内LNP递送实验中，PE8c编辑效率达到14%，PE8d达到10%，PE8max达到4.8%，相比原系统最高提升约2.9倍。

此外，研究还发现PE8并未增加indel副产物，也未明显增加脱靶编辑，说明其性能提升并未以牺牲编辑精度为代价。

图5：PE8在原代细胞与小鼠体内的治疗级编辑表现。

讨论：AI在蛋白工程中的新角色

这项研究展示了一种非常重要的新范式：利用AI辅助蛋白重设计来“修复”实验室进化所带来的稳定性代价。

过去，蛋白质工程往往聚焦于催化效率的提升，而或多或少忽视了稳定性与表达能力的平衡。本研究证明，即使一个蛋白已经经历了多轮实验室进化，仍然可以通过深度学习模型对其整体的生物物理性质进行进一步优化。更重要的是，这种策略很可能具有普适性。研究人员提出，类似的方法未来可应用于更多复杂的生物工程系统，包括碱基编辑器、重组酶、RNA编辑工具以及其他大型多结构域酶系统。

从更广阔的视角看，这项研究也体现了AI在蛋白质工程中正在扮演的新角色：AI不再仅仅是结构的预测者，而是能够直接参与“恢复”与“增强”实验室进化蛋白的“可开发性”。这意味着未来的蛋白质工程可能会逐渐形成“实验室进化（追求活性） + AI稳定化设计（保障质量）”的双轮驱动模式。

对于基因治疗领域而言，PE8系列的出现无疑将Prime editing向真实的临床应用又推进了一步。尤其是在LNP递送、原代细胞编辑以及体内治疗这些场景中，蛋白的稳定性和表达能力，往往是最终决定疗效成败的关键因素。