PNAS｜AI设计小蛋白抑制剂为δ冠状病毒提前备药

解读论文：Computational design of an ultrapotent deltacorona virus miniprotein inhibitor

这篇文章的主角不是新冠病毒，而是一种公众更少听到、但在动物和人之间已经露出跨种传播苗头的冠状病毒：猪δ冠状病毒，简称PDCoV，也常被译作猪丁型冠状病毒。

故事可以从海地的几个儿童病例说起。此前研究在海地儿童样本中检测到PDCoV感染，并提示不止一次独立的人畜跨种传播事件。它还没有像SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2那样引发全球公共卫生危机，但这类病毒提醒我们，冠状病毒的跨种传播往往不是突然发生的，它会先在动物、环境和偶发人类感染之间留下信号。

这篇论文来自美国华盛顿大学Da vid Veesler团队、犹他大学Tyler Starr团队，以及Vir Biotechnology旗下Humabs Biomed等合作团队。研究者没有从康复者血液里找抗体，也没有从传统小分子库里慢慢筛药，而是用计算蛋白设计直接生成一批能贴住PDCoV刺突蛋白受体结合域的小蛋白。最后筛出的核心分子叫MB11。

MB11的表现很突出：它能以皮摩尔级亲和力结合PDCoV受体结合域，在假病毒体系中以216 pM的半数抑制浓度中和PDCoV；它还能中和亲缘距离很远的部分δ冠状病毒；冷冻电镜结构显示，它的工作方式很直接——贴在病毒刺突蛋白与宿主受体APN接触的位置，把病毒进入细胞的那一步挡住。

这项研究的分量不在于它已经是一款药，而在于它展示了一条越来越清晰的路径：面对有跨种风险、但尚未形成大规模流行的病毒，科研可以提前做出一批可验证、可优化、可储备的候选抑制剂。

为什么是PDCoV，为什么要提前做抑制剂

冠状病毒不是一个单一的故事。我们熟悉的SARS、MERS和COVID-19都由β冠状病毒引发，但冠状病毒家族远比这更大。它们可以感染人、猪、牛、犬、猫、鸟类等多种宿主，临床表现也从轻微呼吸道感染到严重呼吸道、胃肠道甚至系统性疾病不等。病毒真正危险的地方，常常藏在宿主转换这一环：只要它的刺突蛋白能换一种方式识别新的受体，原本局限于动物的病毒就可能获得进入人类细胞的机会。

PDCoV最早在香港的病毒监测中被发现，后来在多个国家和地区的猪群中引发或参与肠道疾病流行。对养猪业来说，它对应的是仔猪腹泻、呕吐、脱水等问题；对公共卫生来说，更值得注意的是它并非只停留在猪这个宿主上。已有研究证明，PDCoV可以利用氨肽酶N，也就是APN，作为进入细胞的重要受体。APN在不同物种中存在保守区域，这为病毒跨物种识别提供了结构基础。

可以把病毒进入细胞想象成一个开门过程。病毒表面的刺突糖蛋白像一把钥匙，宿主细胞表面的受体像门锁。S1亚基负责找门锁，S2亚基负责推动膜融合。对PDCoV来说，刺突蛋白上的受体结合域会接触APN。只要这个接触被阻断，病毒生命周期最早的一步就会被卡住。

过去几年，针对PDCoV的中和抗体、小分子抑制剂已经有一些研究基础，但整体上仍有两个问题：一是对不同δ冠状病毒的覆盖范围有限；二是PDCoV及相关δ冠状病毒目前还没有获批用于人类的疫苗或特异治疗药物。对于这类尚未形成大流行、但已经出现跨种信号的病毒，药物研发的逻辑更像防火带：不是等火烧起来再铺，而是在火源还分散时先把关键通道摸清楚。

这也解释了为什么这篇文章选择了小蛋白抑制剂。抗体当然强大，但抗体体积大、结构复杂、生产与递送方式相对固定。小蛋白抑制剂通常更紧凑，理论上更容易做稳定性、冻干、局部递送和多价化改造。它们能不能成为药，要看体内保护、免疫原性、药代动力学和真实病毒挑战等后续证据；但作为一种可设计、可工程化的抗病毒分子骨架，它们正在变得越来越有现实意义。

研究思路：先让计算画出候选分子，再用实验逐层筛掉不可靠答案

研究者把目标放在PDCoV IL121_2014毒株刺突蛋白的受体结合域，尤其是与APN受体接触相关的环区。换句话说，他们瞄准的是病毒钥匙真正伸向门锁的那一段。

第一步是计算设计。团队使用BindCraft生成了101个通过初筛的小蛋白设计，长度从54到190个氨基酸不等。随后，他们用AlphaFold3预测这些小蛋白与PDCoV受体结合域形成复合物时的结构，并结合界面评分、预测误差和人工检查，挑出17个候选分子进入实验验证。

实验筛选很快把名单压缩下来。17个候选分子中，16个可以在大肠杆菌中高水平表达；通过生物层干涉技术筛选后，6个显示出对PDCoV S1区域的结合能力。其中MB10和MB11解离速度最慢，说明它们一旦贴上去，就不容易马上掉下来。研究者最终选择MB11做深入研究，因为它相比MB10有更好的单分散性，这对后续结构解析和药物开发都很重要。

MB11与PDCoV受体结合域的平衡解离常数为155 ± 28 pM，复合物解离半衰期约16 ± 12小时。这里的pM是皮摩尔浓度，数值越低，通常代表结合越紧。在假病毒中和实验中，MB11抑制PDCoV刺突介导入侵的半数抑制浓度为216 pM，是这一轮候选分子中最强的一类。

上图展示了研究者从计算设计到实验筛选的第一轮流程：候选微型结合蛋白被预测为贴合PDCoV受体结合域，随后通过生物层干涉和假病毒中和实验筛选，MB11在结合动力学和中和活性上表现突出。

上图展示了研究者从计算设计到实验筛选的第一轮流程：候选微型结合蛋白被预测为贴合PDCoV受体结合域，随后通过生物层干涉和假病毒中和实验筛选，MB11在结合动力学和中和活性上表现突出。

这不是单纯筛到一个强分子，而是把设计、广谱、抗逃逸和结构机制连起来了

这篇论文的研究内容可以概括成四个层次。

第一层是从头设计。研究者不是从天然抗体库里找现成分子，而是围绕病毒受体结合域设计新的小蛋白形状。计算给出初始答案，实验负责验证哪些答案真的能结合、能中和、能稳定存在。

第二层是广谱性。PDCoV只是δ冠状病毒属中的一个代表。不同δ冠状病毒的受体结合域序列差异很大，这让广谱抑制剂设计变得困难。MB11不只对设计起点PDCoV有效，还能识别并中和部分亲缘距离很远的δ冠状病毒。

第三层是抗逃逸门槛。病毒很会变，单点突变有时就能绕开抗体或抑制剂。研究者用深度突变扫描把PDCoV受体结合域几乎所有单氨基酸替换都测了一遍，观察哪些突变会削弱MB11结合，同时又不会显著损害APN受体结合。结果显示，MB11的逃逸空间比较窄，很多能让它逃逸的突变同时会伤害病毒自己进入细胞的能力。

第四层是结构闭环。冷冻电镜结构证明，MB11确实贴在预期位置，并通过空间位阻阻挡APN受体结合。这一步很关键，因为它把计算设计、功能实验和分子机制连成了一条完整证据链。

结果一：MB11不只强，还覆盖了亲缘距离很远的部分δ冠状病毒

PDCoV本身只是起点。研究者进一步把MB10和MB11放到一个覆盖δ冠状病毒多样性的受体结合域面板里测试。MB11能够结合多个进化分支中的受体结合域，包括与PDCoV IL121_2014受体结合域氨基酸序列一致性只有59% 的MuniaCoV HKU13。

后续生物层干涉实验显示，MB11能结合PDCoV、SparrowCoV ISU42824和MuniaCoV HKU13的受体结合域，但不结合A vianCoV rub035cor1。这个边界并不奇怪，因为A vianCoV rub035cor1与PDCoV IL121_2014受体结合域的序列一致性只有23% ，结构预测也提示其关键环区存在明显差异。

中和实验的结果更有画面感。MB11中和PDCoV假病毒的IC50为216 pM，中和SparrowCoV假病毒的IC50甚至达到14 pM，对MuniaCoV假病毒的IC50为152 nM。但对A vianCoV rub035cor1，研究者在最高40 μM浓度下也没有观察到中和。这个结果给出的信息很清楚：MB11具有广谱潜力，但它不是覆盖所有δ冠状病毒的万能分子。

与此前报道的PD33抗体Fab片段相比，MB11在这组实验中表现出更强的效力和更宽的覆盖范围。PD33 Fab只中和PDCoV IL121_2014假病毒，IC50为611 pM。对于一个单体小蛋白来说，MB11能同时做到低pM级活性和跨分支中和，是相当罕见的表现。

上图概括了MB11的广谱结合与中和表现。它能识别并中和多个δ冠状病毒代表，但对受体结合域差异极大的A vianCoV rub035cor1没有检测到有效结合和中和，显示出广谱能力及其边界。

上图概括了MB11的广谱结合与中和表现。它能识别并中和多个δ冠状病毒代表，但对受体结合域差异极大的A vianCoV rub035cor1没有检测到有效结合和中和，显示出广谱能力及其边界。

结果二：深度突变扫描把病毒可能的逃逸路线提前摊开

抗病毒分子最怕的不是一次实验里表现强，而是病毒很快找到绕路方式。研究者没有等病毒逃逸后再追踪，而是主动做了深度突变扫描：把PDCoV受体结合域中的单氨基酸突变系统性铺开，测这些突变对MB11等小蛋白结合的影响，同时结合这些突变对APN受体结合能力的影响。

结果显示，削弱MB11结合的突变主要集中在受体结合域的第1和第3环区。这里正是MB11贴住病毒的位置。问题在于，很多逃逸突变会同时显著降低病毒对鸡源APN的结合能力。对病毒来说，这相当于为了躲开抑制剂，把自己开门的钥匙也磨坏了。

文章讨论中提到，真正可能在不严重损害受体结合的情况下帮助逃逸的主要位点集中在Y394和V395。在已知PDCoV分离株中，研究者只发现一个相关突变N397D出现在PDCoV GXCZ04-2021中；V395N则出现在A vianCoV rub035cor1里，这也解释了为什么MB11不结合、不处理中和这个病毒。

这组数据给MB11加了一层现实意义。它不是完全没有逃逸风险，任何抗病毒分子都不该这样理解；但它把病毒可走的路压得比较窄。未来如果把MB11与其他逃逸谱不同的小蛋白或抗体组合使用，理论上还能继续抬高病毒逃逸门槛。

结果三：MB11对热、低pH和多种蛋白酶有较好耐受，但胃蛋白酶是一个明确边界

PDCoV在猪中是肠道致病病毒，因此如果未来考虑预防或治疗，递送到黏膜，尤其是肠道黏膜，会是一个很自然的方向。肠道环境并不温和：温度、pH变化、蛋白酶消化，都会让蛋白类药物面临失活风险。

研究者把MB11放在多种生化压力下测试。MB11经过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和羧肽酶A处理后，电泳迁移率只出现轻微变化或几乎没有变化，并且仍保留对PDCoV受体结合域的结合能力。这些小变化可能来自柔性标签被切掉，而不是核心结合结构被破坏。

更有意思的是低pH和高温测试。MB11在pH 2.2环境中孵育2小时，再稀释回中性缓冲液后，结合能力没有明显下降；在70°C处理1小时后，也仍能结合PDCoV受体结合域。分析型凝胶过滤结果还提示，低pH和高温处理后没有明显聚集。

但边界也很清楚：当MB11在pH 2.2条件下接受胃蛋白酶处理时，会被明显降解并失去结合能力。这一点对未来口服递送尤其重要。MB11本身耐酸，不等于它能裸露穿过胃蛋白酶环境。若要走口服路线，仍需要冻干制剂、包埋、递送载体或mRNA表达等策略来保护它抵达目标位置。

上图展示了MB11在多种生化压力下的稳定性测试。MB11在多种肠道相关蛋白酶处理、低pH处理和70°C热处理后仍能保持结合能力，但在低pH条件下经胃蛋白酶处理会被降解。

上图展示了MB11在多种生化压力下的稳定性测试。MB11在多种肠道相关蛋白酶处理、低pH处理和70°C热处理后仍能保持结合能力，但在低pH条件下经胃蛋白酶处理会被降解。

结构机制：MB11挡住的是APN这扇门

为了看清MB11到底怎么工作，研究者解析了MB11结合PDCoV受体结合域的冷冻电镜结构，整体分辨率达到2.8 Å。为了让这个相对较小的复合物更容易被电镜看清，团队还引入了不抑制病毒的PD3抗体Fab片段和抗κ轻链纳米抗体来增加复合物刚性和分子量。

结构结果非常干净：实验解析出的MB11-受体结合域复合物与AlphaFold3预测结构高度吻合，Cα RMSD约0.6 Å。这说明计算设计不仅给出了能结合的分子，也相当准确地预判了它的结合姿势。

MB11本身以α螺旋为主，形成一个略带凹面的表面，像一个贴合病毒受体结合环区的夹具。它主要容纳PDCoV受体结合域的第1和第3环区，对第2环区接触较弱。结合界面埋藏面积约800 Ų，涉及极性相互作用、形状互补、范德华作用、π堆叠、氢键以及对第3环区的β片层延伸。

结构还解释了为什么MB11能挡住病毒进入细胞。PDCoV受体结合域与人APN结合的结构叠合后可以看到，MB11所在的位置与APN接触路径发生空间冲突。竞争性生物层干涉和ELISA实验进一步证明，MB11会阻断PDCoV和MuniaCoV受体结合域与APN结合；而对本来就不结合MB11的A vianCoV rub035cor1，MB11也不会阻断其与Munia APN的结合。

这就是MB11中和病毒的核心机制：它不是破坏病毒颗粒，也不是抑制复制酶，而是在病毒进入细胞之前，先把刺突蛋白伸向APN的关键表面遮住。

上图给出了MB11中和PDCoV的结构基础。冷冻电镜结构显示MB11贴合受体结合域关键环区，并与APN受体结合位置发生空间冲突，从而阻断病毒与宿主受体接触。

上图给出了MB11中和PDCoV的结构基础。冷冻电镜结构显示MB11贴合受体结合域关键环区，并与APN受体结合位置发生空间冲突，从而阻断病毒与宿主受体接触。

从漂亮候选物到真正药物，还需要几段路

MB11的结果已经足够亮眼，但这项研究仍处在临床前候选分子阶段。文章中的中和实验主要使用VSV假病毒系统，它能很好地评估刺突蛋白介导的入侵过程，但不能完全替代真实PDCoV感染模型。下一步还需要真实病毒、动物模型、给药途径、药代动力学、组织分布、重复给药免疫反应等数据。

另外，MB11对胃蛋白酶敏感，这对口服应用提出了具体问题。研究者讨论了几种可能路线，例如口服递送mRNA让局部表达小蛋白，或以冻干形式递送；如果需要系统性给药，也可以考虑把MB11与人Fc片段融合以延长体内半衰期。这些都还属于后续工程化方向，不宜直接等同于已经可用的治疗方案。

还有一个值得保持冷静的点：MB11对部分亲缘很远的δ冠状病毒有效，但对A vianCoV rub035cor1无效。因此它更适合被理解为一个强力、广谱但有边界的先导分子，而不是泛δ冠状病毒万能抑制剂。真正面向储备药物时，可能需要把MB11、多价化MB11、其他小蛋白以及抗体鸡尾酒放进同一套组合策略中评估。

END：真正重要的是把防线往前推

这篇文章让人看到一种新的抗病毒准备方式：先不等疫情发生，也不等人群中间出现大量病例，而是从病毒进入细胞的结构弱点出发，提前设计能堵住关键通道的分子。

MB11像一枚被精确打磨的小楔子，贴在PDCoV受体结合域的凹凸表面上，让病毒难以接触APN这扇门。它强在亲和力，也强在结构解释得通；强在对多个δ冠状病毒有覆盖，也强在研究者提前画出了部分逃逸路线；强在耐热、耐酸和多种蛋白酶，也清楚暴露出胃蛋白酶这一递送难题。

对公众来说，PDCoV未必会成为下一个重大疫情病原。对科研和公共卫生准备来说，这正是值得提前研究的对象。很多防线真正发挥作用的时候，并不在灾难已经发生之后，而是在风险还停留在样本、结构、受体和实验室模型里的时候。

这篇文章的余味也在这里：未来的抗病毒药物储备，可能不再只依赖事后追赶，而会越来越多地来自这样的前置设计——先理解病毒怎样开门，再提前准备一把能卡住门锁的小工具。

参考文献

N.G. A very,C.N. Yoshiyama,A.L. Taylor,Y. Park,D. Asarnow,L. Perruzza,J.T. Brown,D. Corti,F. Benigni,T.N. Starr, & D. Veesler,Computational design of an ultrapotent deltacorona virus miniprotein inhibitor, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 123 (18) e2533456123, https://doi.org/10.1073/pnas.2533456123 (2026).