科研人员必读：多肽、蛋白质、重组蛋白区别及定制指南

# Section.01 ## 多肽 VS 蛋白质 VS 重组蛋白 多肽、蛋白质和重组蛋白，本质上是同宗同源的东西——都是氨基酸串起来的生物大分子。三者的核心区别，说到底无非是三个维度：分子大小、折叠形态，以及生产方式。 接下来是一张清晰的对比图，帮你快速建立直觉：   弄清区别只是第一步，关键在于应用。在实际的抗体筛选、靶点验证、药物递送等场景里，你需要的往往不是货架上的标准品，而是**特定序列的多肽**或**非天然来源的重组蛋白**。这时候，成品库里的选项远远不够，于是就需要**「多肽 & 重组蛋白定制服务」**。 # Section.02 ## 多肽定制 ### 一、什么是多肽定制？ 简单来说，**多肽定制**就是根据你手头实验的特定需求——比如精确到某某序列的氨基酸、某某分子量、某某纯度、某某修饰方式——通过化学或生物技术，专门人工合成出一条属于你的多肽。目录产品满足不了的时候，就是它登场的时候。 ### 二、为什么要定制多肽？ 当然是因为：有需求。 举个例子： **(1) 高度个性化**：目录产品多肽无法贴合实验需求，定制则可以完全按需设计，甚至可以引入同位素标记、荧光标记（如 FITC、Cy3）等特殊基团，用于追踪细胞内反应。 **(2) 提高稳定性与活性**：通过 N 端乙酰化、C 端酰胺化、环化等特殊化学修饰，能有效抵抗生物体内酶的降解，从而增强药效或生物利用度。 **(3) 结构与功能研究**：无论是抗体制备、受体研究、多肽文库筛选，还是酶活性位点探索，定制多肽都是核心工具。 **(4) 新药与功能性产品开发**：开发多肽相关药物，这更是基础中的基础。  图 1. 多肽定制的常见类型。 接下来，看看几种常见的多肽定制场景，结合文献应用来帮助大家选择。 ### 场景一：荧光标记肽 荧光标记肽是**应用极其广泛的功能化多肽**。它的核心思路是在多肽的 N 端、C 端或特定位点**偶联 FAM、FITC、Cy5、TAMRA 等荧光染料**，从而实现对多肽或其识别分子在细胞、组织、活体中的**动态追踪**。相比传统放射性标记，荧光标记操作更安全、成像更直观、适用于活细胞实验这些优势非常突出，因此在受体结合、细胞摄取等研究领域被大量采用。 需要注意，荧光团类型与标记位点会直接影响多肽的受体结合能力与生物学功能，甚至可能导致活性显著下降或完全丧失。下面这篇文献就探究了不同荧光团标记 Substance P后多肽与受体结合的活性差异。所以，做荧光标记肽设计时，一定要参考文献报道和活性区域来谨慎选择。  图 2. 不同荧光团标记 Substance P 在 CHO 细胞中的成像图[1]。(A) Alexa 488-SP, (B) BODIPY Fl-SP, (C) fluo-rescein-SP, (D) Oregon Green 488-SP, (E) tetramethylrhodamine-SP, (F) PBS 除了单荧光标记肽，基于荧光团/淬灭基团标记的 FRET 多肽则更巧妙——它将分子水平的酶活响应和结构变化转化为荧光信号输出，提供了一个灵敏、快速的检测工具。 ### 场景二：脂肪酸修饰肽 脂肪酸修饰是目前**应用最成熟的长效化多肽修饰策略**。通过在多肽上**引入棕榈酸、硬脂酸等疏水链**，使其与血清白蛋白发生可逆结合，从而显著**降低肾清除率，延长体内停留时间**。 在 GLP-1 类似物中，脂肪酸修饰肽已经被反复优化并取得了临床成功。Liraglutide 通过在 Lys26 位连接棕榈酸（C16），使其与白蛋白高亲和结合，将天然 GLP-1 约 2 分钟的半衰期延长至约 13 小时，实现每日给药。在此基础上进一步优化的 Semaglutide，则采用 C18 脂肪二酸结合改造，使其半衰期延长至约一周，支持每周一次给药方案。  图 3. 脂肪酸修饰的生物学价值：延长半衰期、降低免疫原性，细胞内摄取及跨上皮屏障递送[2]。 ### 场景三：同位素标记肽 同位素标记肽是**蛋白质组学与定量分析中最标准化的多肽定制形式**。核心思路是**引入¹³C、¹⁵N 或 ²H 等稳定同位素**，在质量数上构建“重/轻肽对”，从而在 LC-MS/MS 体系中**实现高精度绝对定量或相对定量分析**。典型策略如 AQUA（Absolute Quantification）肽，即在已知浓度基础上合成稳定同位素标记肽作为内标，用于目标蛋白或修饰肽的精确定量。 实际应用中，同位素标记肽广泛用于靶向蛋白定量（SRM/MRM/PRM）、生物标志物验证以及信号通路定量分析。比如在膜蛋白与 GPCR 研究中，往样品中加入已知浓度的重标记肽标准，就可以直接计算内源肽的绝对含量，绕过传统抗体法带来的批次差异与交叉反应问题。由于重标记与天然肽在化学性质上几乎一致（仅质量差异），两者在色谱行为和离子化效率上高度一致，因此成为定量体系中最可靠的内部参照物之一。 ### 场景四：点击化学修饰肽 点击化学修饰肽是近年来发展迅速的一类功能化多肽定制策略。核心是利用叠氮（–N₃）与炔基（–C≡C）等生物正交反应基团，在温和条件下实现高选择性偶联，从而将荧光团、小分子药物或纳米材料精准连接到多肽上。点击化学本质上属于“模块化连接策略”，优势不仅在于反应效率高，更重要的是可以实现不同功能模块（靶向肽、成像基团、药物载荷）之间的快速组合。因此，它已经成为 PDC、放射性核素偶联药物以及多功能多肽构建中最常用的偶联方式之一。  图 4. 通过点击化学连接寡糖和多肽链的化学结构示例[3]。 ### 场景五：DSPE-PEG-多肽偶联物 DSPE-PEG-多肽偶联物是脂质体与纳米递送体系中最常用的表面功能化策略之一。它的基本结构由疏水性 DSPE 脂质锚定在膜结构中，亲水性 PEG 作为柔性间隔臂，末端连接靶向多肽——这样既保证了体系稳定性，又赋予了特异性识别能力。这类结构被广泛用于靶向脂质体、纳米颗粒及核酸递送体系，用于提升体内循环稳定性并实现组织或细胞特异性摄取。 在纳米递送体系中，DSPE-PEG-多肽偶联物常与细胞穿膜肽（CPP）协同使用，实现体内稳定性与细胞内高效递送的双重目的。比如在其表面引入 TAT 肽，构建出 DSPE-PEG–TAT 共修饰纳米载体，用于肿瘤或组织中的高效细胞摄取与递送。  图 5. 转铁蛋白与细胞穿膜肽双功能修饰肽用于体内外递送质粒以治疗阿尔茨海默病[4]。 ### 场景六：多肽-药物偶联物（PDC） 多肽-药物偶联物（PDC）是指利用具有靶向能力的多肽，将小分子药物、毒素、放射性核素或功能分子定向递送至目标组织。相比传统化疗药物，PDC 靶向性更好，毒副作用相对较低；而相比抗体-药物偶联物（ADC），PDC 分子量更小、化学合成更灵活，优势明显。  图 6. PDC 药物结构示意图[5]。 已获批上市的 Lutathera（¹⁷⁷Lu-DOTATATE）通过将生长抑素类似物与 Lu-177 偶联，实现神经内分泌肿瘤的靶向放疗；而 ANG1005 则由三个紫杉醇分子与 Angiopep-2 肽段共价连接组成，通过低密度脂蛋白受体相关蛋白运输系统穿越血脑屏障，用于脑肿瘤的研究与治疗。 # Section.03 ## 重组蛋白定制 蛋白质可以分为传统天然蛋白质和重组蛋白两大类。 传统天然蛋白质是从动植物组织或微生物中直接提取的（如大豆蛋白、乳清蛋白、胶原蛋白），保留了完整的天然结构与复杂的翻译后修饰（如糖基化）。 **重组蛋白**则是利用基因工程技术，将目的基因导入宿主细胞（如大肠杆菌、酵母菌或哺乳动物细胞）中进行发酵表达而生产的。它不仅能生产天然存在的蛋白质，还可以通过改造氨基酸序列来增强特定功能。其优势在于纯度高、批次稳定、安全性好、易于规模化制备，主要用于生产重组人胰岛素、细胞因子、单克隆抗体等靶向药物。1982 年重组人胰岛素（Humulin，优泌林）被 FDA 批准为首个重组蛋白药物。  图 7. MCE 重组蛋白定制基本流程。 ### 常见重组蛋白类型 **『五大表达系统』** 不同表达系统各有特点，可以根据蛋白特性和后续应用灵活匹配。 - **大肠杆菌表达**：经济、高产、快速，适合结构相对简单的细菌蛋白、抗原、酶类等，是性价比最高的选择。 - **大肠杆菌无细胞表达**：体外合成，无需活细胞培养，特别适合对宿主有毒性的蛋白以及多次跨膜蛋白，可添加去垢剂维持膜蛋白溶解状态。 - **酵母细胞表达**：低成本的真核表达平台，具备一定的翻译后修饰能力，适合分泌蛋白及小分子蛋白。 - **哺乳动物细胞表达**：最接近天然状态的表达平台，提供完整的人源化翻译后修饰（如糖基化、磷酸化），适合重组抗体、细胞因子等需要复杂修饰的蛋白。 - **昆虫细胞表达**：基因承载容量大，支持大分子量蛋白和激酶的表达。 **『多种融合标签』** 标签的选择直接影响纯化效率和下游应用。支持多种融合标签，可根据实验需求灵活搭配。 - **常规纯化标签**：His 标签（镍柱纯化，分子量小）、GST 标签（Glutathione 亲和纯化，兼具促溶作用）、Fc 标签（Protein A/G 亲和纯化，适合免疫相关实验）、Flag 标签（Anti-FLAG 亲和凝胶纯化，温和洗脱，保持活性）、Strep 标签（Strep-Tactin 亲和纯化，高纯度需求优选） - **促溶标签**：MBP、SUMO、GST 等，可显著提高难表达蛋白的可溶性 - **功能标签**：A vi 标签（常用于定点生物素化）、GFP（荧光标记，用于蛋白定位示踪） - **无标签蛋白**：如需天然构象或去除标签干扰，也支持无标签蛋白制备 **『定制需求』** - **膜蛋白**：拥有三大膜蛋白表达技术平台，包括去垢剂平台（基于哺乳动物细胞表达系统）、纳米盘（Nanodisc）技术平台和病毒样颗粒（VLPs）技术平台，通过为膜蛋白提供模拟天然脂质环境，有效维持其天然构象与生物活性。 - **生物素化标记**：通过随机标记或者 A vi 定点生物素化，适用于蛋白相互作用研究 - **荧光标记**：融合 GFP、mCherry 等荧光蛋白，或化学标记 FITC、Cys 系列染料，用于细胞成像及示踪实验 - **包涵体复性**：对于原核系统中形成包涵体的蛋白，可提供变复性服务，筛选最优复性条件，尽可能恢复蛋白活性 - **突变体及截短体**：点突变、结构域删除、截短体等，均可按需构建并表达纯化 ### 案例分享 **『无细胞表达』** **▶解决高疏水跨膜蛋白难题** - **难点**：人源 SLC7A11 蛋白，含 12 次跨膜结构，表达量低、可溶性差，纯化困难 - **制备**：采用大肠杆菌无细胞体系，通过添加 DNA 模板、细胞抽提物及其他原料实现蛋白的体外合成；利用 Brij78、FOS12、DDM 等去垢剂，能够有效促进膜蛋白溶解，维持其天然构象。  图 8. 纯化结果图和活性验证图。 **『昆虫细胞表达』** **▶攻克超大分子量蛋白制备** - **项目难点**：人源 HLTF 蛋白，分子量高达 115 kDa，大分子蛋白分泌困难、表达量低，纯化难度大 - **制备**：采用杆状病毒介导昆虫细胞表达，迭代优化 P0-P2 代病毒，通过结合亲和、离子交换、疏水及分子筛等多种层析方法纯化目的蛋白。  图 9. 纯化结果图。 ## 参考文献 [1] Simmons MA, et al. Analysis of fluorescently labeled substance P analogs: binding, imaging and receptor activation. BMC Chem Biol. 2001;1(1):1. [2] Lynch MD, et al. A review of lipidation in the development of advanced protein and peptide therapeutics. J Control Release. 2019 Feb 10;295:1-12. [3] Danishefsky SJ, et al. A potentially valuable advance in the synthesis of carbohydrate-based anticancer vaccines through extended cycloaddition chemistry. J Org Chem. 2006 Oct 13;71(21):8244-9. [4] Singh J, et al. Synthesis and Characterization of Transferrin and Cell-Penetrating Peptide-Functionalized Liposomal Nanoparticles to Deliver Plasmid ApoE2 In Vitro and In Vivo in Mice. Mol Pharm. 2025 Jan 6;22(1):229-241. [5] Bugatti K. A Brief Guide to Preparing a Peptide-Drug Conjugate. Chembiochem. 2023 Sep 1;24(17):e202300254.